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［通讯作者］张弘（１９８１—），女（汉），博士，讲师，研究方向：药物抗肿瘤作用机制研究．Ｅ?ｍａｉｌ：ｓｏｎｇ０６８８＠ｓｉｎａ.ｃｏｍ

［摘要］目的：考察甲磺酸伊马替尼（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）与高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）联合给药在人类慢性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）细胞株ＫＣＬ２２细胞中的抗白血病作用。方法：采用ＤＡＰＩ荧光染色法以及ＰＩ染色的流式细胞术，考察ＨＨＴ和Ｉｍａｔｉｎｉｂ单独及联合给药对ＫＣＬ２２细胞的诱导凋亡作用；采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法考察单独及联合给药对ＫＣＬ２２细胞凋亡相关蛋白的作用。结果：ＨＨＴ能够与Ｉｍａｔｉｎｉｂ协同抑制ＫＣＬ２２细胞生长并诱导其凋亡，并在多个剂量和不同作用时间下，二者均表现协同的作用；能显著引起凋亡蛋白ＰＡＲＰ的裂解，并下调抗凋亡蛋白Ｍｃｌ－１的表达水平。结论：ＨＨＴ与Ｉｍａｔｉｎｉｂ协同抑制ＫＣＬ２２细胞的生长并诱导其凋亡，具有协同抗ＣＭＬ效应。

［关键词］高三尖杉酯碱；甲磺酸伊马替尼；慢性粒细胞白血病；细胞凋亡

高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＨＨＴ）、三尖杉酯碱（ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＨＴ）、异三尖杉酯碱（ｉｓｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＩＨＴ）是从我国特有植物粗榧、海南粗榧中提取的生物碱，其中ＨＨＴ抗肿瘤活性最强［１－２］。２０世纪７０年代我国率先将ＨＨＴ应用于急性白血病的临床治疗。现有的研究表明ＨＨＴ及其衍生物能够抑制白血病细胞蛋白质和核酸的合成［３－４］。慢性粒细胞白血病（ｃｈｒｏｎｉｃｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓｌｅｕｋｅｍｉａ，ＣＭＬ）是起源于骨髓内以粒系细胞增生为主要表现的血液系统恶性克隆性疾病。超过９０％的ＣＭＬ患者存在Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ染色体，并特异表达具有酪氨酸激酶（ＴＰＫ）活性的ＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白，以甲磺酸伊马替尼（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）为代表的靶向作用于ＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂（ＴＫＩｓ）的临床应用，使得ＣＭＬ的治疗发生了根本性转变，并成为治疗ＣＭＬ的首选药物［５－６］。本研究将ＢＣＲ／ＡＢＬ蛋白激酶抑制剂Ｉｍａｔｉｎｉｂ与ＨＨＴ联合给药，考察二者合用在ＣＭＬ细胞中的抗白血病作用，希望为临床治疗ＣＭＬ患者提供更为合理有效的治疗方案。

１材料与方法

１.１实验材料ＨＨＴ（北京协和药厂）；Ｉｍａｔｉｎｉｂ（美国Ｓｉｇｍａ公司）；胎牛血清（澳大利亚Ｃｌａｒｋ公司）；ＲＰＭＩ－１６４０培养基（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司）；人类ＣＭＬ细胞系ＫＣＬ２２细胞（美国ＡＴＣＣ公司）；４′，６－二脒基－２－苯基吲哚（ＤＡＰＩ，１００ｎｇ／ｍｌ）、碘化丙啶（ＰＩ）（日本Ｗａｋｏ公司）；兔抗ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ－（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）单克隆抗体（美国Ａｂｃａｍ公司）；鼠抗ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎ单克隆抗体（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）；兔抗Ｍｃｌ－１单克隆抗体（美国ＢＤ公司）；增强型ＥＣＬ化学发光试剂盒（德国Ｍｅｒｃｋ公司）；蛋白定量试剂盒（碧云天公司）。

１.２细胞培养将人类ＣＭＬ细胞系ＫＣＬ２２细胞培养于３７℃、５％ＣＯ２的饱和湿度培养箱中。所用ＲＰＭＩ－１６４０培养基中加入１０％（ｖ／ｖ）经加热灭活的胎牛血清，１００Ｕ／ｍｌ青霉素和１００Ｕ／ｍｌ链霉素混合双抗，以及１ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺。

１.３ＤＡＰＩ荧光染色法进行细胞凋亡的形态学观察复筛的细胞连续生长至对数生长期，将细胞接种于６孔板中，以每孔２×１０５／ｍｌ的细胞密度接种ＫＣＬ２２细胞，每孔加入４ｍｌ培养基。采用相应浓度药物处理相应时间后，取２ｍｌ细胞悬液，２０００ｒ／ｍｉｎ，离心３ｍｉｎ，弃去细胞上清液，重悬于２００μｌ冰预冷的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）中。将细胞悬液加入带有滤纸片的载玻片套管中离心制片，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心３ｍｉｎ，室温放置２０ｍｉｎ固定，然后加入ＤＡＰＩ染料５０μｌ，用盖玻片封片，染色１０ｍｉｎ。在荧光显微镜３６０ｎｍ激发波长下记录并观察ＫＣＬ２２细胞的染色情况和细胞形态学改变。细胞呈现ＤＡＰＩ着色蓝色荧光并出现核皱缩、断裂、边缘化、发泡、发芽及凋亡小体等典型凋亡形态的细胞被认为是早期凋亡细胞。细胞若呈现较弱ＤＡＰＩ着色蓝色荧光，细胞膨大破损，说明细胞已经死亡，为坏死细胞或晚期凋亡细胞。

１.４细胞ＰＩ单染的流式细胞术（ＦＣＭ）检测ＫＣＬ２２细胞分别经０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ和０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ处理２４ｈ后离心收集细胞（３×１０６个），经冰预冷的ＰＢＳ洗涤，用５００μｌＰＢＳ重悬细胞，加入５０ｍｌ冰预冷的７５％乙醇固定，过夜。离心收集细胞，ＰＢＳ洗涤后于５００μｇ／ｍｌ的ＲＮａｓｅ溶液中３７℃孵育３０ｍｉｎ，加入ＰＩ染色液染色１０ｍｉｎ。制备样品中ＤＮＡ含量采用流式细胞术检测，测定吸收波长为６２５ｎｍ，激发波长为４８８ｎｍ。横坐标代表细胞染色荧光发射强度即ＤＮＡ的含量，纵坐标代表所采集细胞的总数。检测所得数据采用ＦＣＭ分析系统软件（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）进行分析处理。

１.５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法考察了ＨＨＴ和Ｉｍａｔｉｎｉｂ单独和联合给药后ＫＣＬ２２细胞凋亡指示蛋白ＰＡＲＰ蛋白的活化裂解情况，以及Ｍｃｌ－１的蛋白表达水平。样品细胞总蛋白（２００μｇ）通过ＲＡＰＡ细胞裂解缓存液裂解得到，采用蛋白定量试剂盒定量蛋白，通过Ｂｉｏ－Ｒａｄ垂直凝胶电泳分离蛋白，并将总蛋白通过转印半干转移系统转印到硝酸纤维素膜上，采用含有５％脱脂奶粉的ＴＢＳＴ缓冲液孵育１ｈ，将硝酸纤维素膜与相应特异性单克隆抗体于４℃孵育过夜。采用ＴＢＳＴ洗涤３次后，与相应抗体对应的二抗室温孵育１ｈ后ＴＢＳＴ洗涤１次，经增强型化学发光试剂（ＥＣＬＫｉｔ）孵育１０ｍｉｎ后于蛋白凝胶显色系统（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）显色并进行图形采集。１.６统计学方法采用ＳＰＳＳ１５.０软件进行统计学分析。所得数据以均数±标准差表示，多组间比较采用Ｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡ，两两比较采用ｑ检验，Ｐ＜０.０５为差异有统计学意义。

２结果

２.１Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ联合给药诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡的形态学观察通过细胞核荧光染料ＤＡＰＩ染色后采用荧光显微镜观察Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ单独给药及联合给药诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡作用。给予０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ或０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ单独处理ＫＣＬ２２细胞２４ｈ，均未能诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡；当采用０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ和０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ联合处理ＫＣＬ２２细胞２４ｈ，可观察到ＫＣＬ２２细胞明显的凋亡形态，Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡具有协同作用，见图１。

２.２在不同剂量下，Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ联合给药诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡分别将Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ以不同的浓度单独或联合给药ＫＣＬ２２细胞２４ｈ，采用ＤＡＰＩ荧光染色的细胞计数法对凋亡细胞计数，结果表明，单独给予ＫＣＬ２２细胞０.１、０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ或０.２、０.４μｍｏｌ／ＬＨＨＴ不能诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡，当采用０.２、０.４μｍｏｌ／ＬＨＨＴ与０.１μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ联合给药细胞２４ｈ，则分别诱导（４９±４.２）％和（７７±３）％的ＫＣＬ２２细胞凋亡；采用０.２、０.４μｍｏｌ／ＬＨＨＴ与０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ联合给药细胞２４ｈ，则分别诱导（６６±３.２）％和（９２±２）％的ＫＣＬ２２细胞凋亡，Ｉｍａｔｉｎｉｂ与不同浓度ＨＨＴ合用均协同诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡，见图２。

２.３在不同作用时间点下，Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ联合给药诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡以培养１２、２４、４８ｈ的ＫＣＬ２２细胞作为对照，分别将Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ各以０.２μｍｏｌ／Ｌ单独或联合给药ＫＣＬ２２细胞１２、２４、４８ｈ，采用ＤＡＰＩ荧光染色的细胞计数法对凋亡细胞计数，结果表明，单独给予ＫＣＬ２２细胞０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ或０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ处理１２、２４、４８ｈ，不能有效诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡；当采用０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ与０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ联合给药１２、２４、４８ｈ，则分别诱导（２５±２.７）％、（６４±４.３）％、（９３±１.９）％的ＫＣＬ２２细胞凋亡，可见在多个作用时间点下，Ｉｍａｔｉｎｉｂ与ＨＨＴ合用均可协同诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡，见图３。

２.４Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ联合给药诱导ＫＣＬ２２细胞凋亡的流式细胞术检测给予０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ或０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ单独处理ＫＣＬ２２细胞２４ｈ后采用流式细胞术ＰＩ染色检测，ＫＣＬ２２细胞分别有５.３％和７.９％细胞发生凋亡，与对照细胞２.７％凋亡率相比未出现显著的诱导细胞凋亡作用。当采用０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ和０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ联合处理ＫＣＬ２２细胞２４ｈ，采用流式细胞术ＰＩ染色可以检测出显著的ＳｕｂＧ１期凋亡峰的存在，约６３.５％的ＫＣＬ２２细胞出现细胞凋亡，见图４。

２.５Ｉｍａｔｉｎｂ和ＨＨＴ联合处理ＫＣＬ２２细胞对细胞凋亡通路相关蛋白的作用将ＫＣＬ２２细胞分别给予０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ和０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ处理２４ｈ，其抗凋亡蛋白Ｍｃｌ－１的蛋白表达水平下调并不显著，当对ＫＣＬ２２细胞联合给予０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａ?ｔｉｎｉｂ和０.２μｍｏｌ／ＬＨＨＴ处理２４ｈ后，其抗凋亡蛋白Ｍｃｌ－１的蛋白水平显著下调，同时细胞凋亡指示蛋白ＰＡＲＰ被协同活化，见图５。

３讨论

现有的研究表明，Ｉｍａｔｉｎｉｂ并不能完全治愈ＣＭＬ，并随着ＢＣＲ－ＡＢＬ酪氨酸激酶抑制剂的广泛应用，临床上对Ｉｍａｔｉｎｉｂ出现了广泛的耐药性。近年来的报道表明，ＨＨＴ对Ｉｍａｔｉｎｉｂ耐药的ＣＭＬ仍然敏感，对ＢＣＲ－ＡＢＬ酪氨酸激酶突变的ＣＭＬ患者仍然有效，美国ＦＤＡ已在２０１２年批准ＨＨＴ用于治疗初治及酪氨酸激酶抑制剂耐药的难治ＣＭＬ［７］。因此将Ｉｍａｔｉｎｉｂ与ＨＨＴ联合用于ＣＭＬ及耐药ＣＭＬ的临床治疗可能会取得更好的治疗效果。在本研究中，Ｉｍａｔｉｎｉｂ与ＨＨＴ联合给药具有协同诱导ＣＭＬ细胞系ＫＣＬ２２细胞凋亡的作用，并在不同剂量和作用时间点下其抗白血病作用具有良好的协同作用。采用０.２和０.４μｍｏｌ／ＬＨＨＴ处理ＫＣＬ２２细胞１２和２４ｈ，未能显著引起细胞凋亡的发生，同时采用０.１和０.２μｍｏｌ／ＬＩｍａｔｉｎｉｂ处理ＫＣＬ２２细胞１２和２４ｈ也不能够引起显著的细胞凋亡，但在此浓度下将Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ联合给药可显著地诱导ＫＣＬ２２细胞发生凋亡。本研究结果表明，Ｉｍａｔｉｎｉｂ与ＨＨＴ联合给药能够诱导ＣＭＬ细胞系ＫＣＬ２２细胞发生凋亡，将两者联合给药ＣＭＬ细胞具有协同的抗白血病作用。研究表明，ＨＨＴ可以诱导ＣＭＬ细胞凋亡并下调Ｂｃｌ－２家族中抗凋亡蛋白Ｍｃｌ－１的表达水平并发挥诱导细胞凋亡作用［３］，因此应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法考察了Ｉｍａｔｉｎｉｂ和ＨＨＴ单独及联合处理ＫＣＬ２２细胞后Ｍｃｌ－１的蛋白表达水平，以及细胞凋亡指示蛋白ＰＡＲＰ的裂解活化情况。本研究结果发现，Ｉｍａｔｉｎｉｂ与ＨＨＴ联合给药可以显著地下调ＫＣＬ２２细胞Ｍｃｌ－１的表达水平，并能引起细胞凋亡指示性蛋白ＰＡＲＰ的活化和裂解。Ｍｃｌ－１为线粒体抗凋亡蛋白Ｂｃｌ－２家族中重要成员，Ｍｃｌ－１蛋白的抑制或下调均可以引起白血病细胞的凋亡［８－９］。本研究提示ＨＨＴ可能通过下调Ｂｃｌ－２家族中抗凋亡蛋白Ｍｃｌ－１发挥协同Ｉｍａｔｉｎｉｂ诱导ＣＭＬ细胞凋亡的抗白血病作用。综上所述，ＨＨＴ与Ｉｍａｔｉｎｉｂ在不同剂量和不同时间点作用下，可以协同抑制ＫＣＬ２２细胞生长并诱导其凋亡，发挥了协同的抗白血病作用，希望我们的研究为ＣＭＬ的临床治疗提供更为合理和有效的治疗方案。

参考文献略